Cultura in vitro - tudo o que você precisa saber para começar

Hoje falarei sobre o tema que mais acho interessante e mais tenho estudado: a cultura in vitro. Avançada, consiste em reproduzir uma planta em ambiente estéril e equilibrado, sendo assim, sem haver o risco de falta de nutrientes, doenças, pragas, e nem sequer a necessidade de regas. A cultura in vitro pode ser feita de duas formas: a cultura de tecidos, que tem como o objetivo a clonagem de uma planta através de fragmentos (explantes) dela, ou a micropropagação, que geralmente é feita através de sementes para aumentar a taxa de germinação e crescimento (este método é muito utilizado em orquídeas).

É uma técnica amplamente utilizada em laboratórios do mundo inteiro seja para conservar plantas em risco de extinção ou para aumentar a produtividade de uma plantação. Para ser realizada com sucesso, ela deve seguir 5 etapas básicas:

• A obtenção do explante ou da semente
• A esterilização do meio de cultivo e do explante ou semente
• A propagação do explante ou semente no meio
• O enraizamento
• A aclimatação (após a retirada da planta do meio in vitro)

A esterilização do explante e a aclimatação da planta cultivada in vitro ao meio exterior são as duas etapas mais críticas deste processo, pois é nelas onde a planta possui maior risco de morrer.

Cada etapa e cada material utilizado neste processo serão detalhados mais a frente assim como serão mostradas formas caseiras e resultados desta técnica, além de outras como a hidroponia.

Os meios de cultivo

Este é um ponto chave da cultura in vitro. Para quem já conhece hidroponia, ele age de forma similar, é uma solução contendo tudo o que a planta necessita para se desenvolver. Porém na hidroponia ele é uma solução aquosa de sais minerais, enquanto na cultura in vitro é uma solução com textura de gel contendo os sais minerais, vitaminas e até hormônios. Os conteúdos do meio de cultivo dependem do objetivo, já que a cultura in vitro é utilizada desde a simples germinação de sementes até a criação de plantas transgênicas, e obviamente estes dois objetivos possuem meios e procedimentos diferentes. O meio de cultivo pode ser divido da seguinte forma, quanto aos seus ingredientes:

• Água, que representa 95% do meio e é a base da solução.
• Fonte de carbono, que é essencial para a manutenção das plantas. Normalmente se usa a sacarose através do acréscimo de açúcar cristal ao meio.
• Substâncias inorgânicas, que são os sais minerais.
• Vitaminas, no caso do meio de Taji (que eu utilizo e você pode fazer em casa) são usadas o complexo B contendo tiamina e o inositol. Já no meio de Murashige & Skoog são utilizadas muito mais vitaminas, que seriam muitas para listar.
• Hormônios, eles atuam na formação de órgãos e no crescimento da planta. Os principais são IAA, BAP e GA3, que são, respectivamente, auxinas, citocininas e giberelinas.
• Complementos não definidos, como por exemplo a água de coco ou suco de laranja.
• Materiais inertes, são os que atuam dando suporte a planta, como o ágar-ágar, phytagel e outros agentes gelificantes.

Todos esses componentes fornecerão todas as condições de crescimento para a planta e são variáveis. É sempre interessante buscar fazer teste com novos ingredientes ou em novas concentrações para definir qual oferece o melhor resultado para a sua cultura. Em breve abordarei os meios mais utilizados (Murashige & Skoog, Taji e coco) e os ensinarei a fazer (com exceção do Murashige & Skoog, que é um meio preparado exclusivamente em laboratórios).

Hormônios, são eles as auxinas (com destaque para o IAA) que promovem o alongamento celular e a formação de raízes, inibindo gemas axilares, as citocininas (com destaque para o BAP) que controlam a divisão celular e crescimento das tecidos. Existem também as giberelinas, como o GA3 que atua na germinação e no crescimento da planta. Existe uma relação entre citocininas e auxinas que determina se haverá organogênese ou calogênese, porém não me lembro com exatidão, caso alguém saiba pode indicar nos comentários.

Como preparar os meios de cultura

Levando em conta que água sanitária, plantas e potes de vidro nós achamos em todo o lugar, talvez a maior dificuldade seja encontrar um meio de cultura para ser utilizado. Existem diversos meios, desde os mais básicos até os mais avançados, como o de Knop, Acram Taji, Kyoto, Murashige & Skoog e alguns outros que são improvisados por aí. Hoje irei ensinar apenas os meios caseiros para plantas comuns, carnívoras e orquídeas.

Meio Taji

• 1 litro de água
• De 2,5g a 3g de adubo NPK (eu utilizo 3g, similar ao meio de Kyoto)
• 10g de açúcar cristal
• 0,4mg de tiamina
• 100mg de inositol
• 7g de ágar-ágar

Meio de Kyoto

• 1 litro de água
• 3g de adubo NPK
• 10g de açúcar cristal
• 10g de ágar-ágar

Meio para orquídeas

• 1 litro de água
• 60g de tomate
• 20g de açúcar cristal
• 7g de ágar-ágar

Meio Murashige & Skoog

• Caso queira saber a formulação deste meio, basta acessar o arquivo: PDF para preparação de meio MS

Complemento com água de coco

• Adicionar 100ml de água de coco em qualquer meio acima.

Como preparar o meio

• Misture tudo, com exceção do ágar-ágar, e bata no liquidificador.
• Após isso, meça e ajuste o pH, ele deve estar entre 5,0 e 6,0 (pode ser usado bicarbonato de sódio para aumentar (alcalinizar) o pH ou vinagre para fazer o efeito inverso). Para medir o pH pode comprar um medidor pela internet ou usar um desses para aquário vendidos em pet shop.
• Aquecer o meio de cultura no microondas (cerca de 2 minutos) e adicionar o ágar-ágar. O ágar-ágar derrete quando a temperatura está acima de 90ºC e se solidifica quando a temperatura fica abaixo de 50ºC.
• Agora que o meio de cultura já está pronto basta esterilizar, que será assunto da próxima parte. Mas caso já queira adiantar, basta deixar por 20 minutos (contados a partir do início do barulho de saída de pressão) na panela de pressão.

Atenção: Apenas potes de vidro ou polipropileno aguentam ir na panela de pressão, e sempre deixe toda a pressão sair e a panela esfriar naturalmente para retirar os potes. Caso retire eles antes da hora pode causar um choque térmico e estragar os potes.

Algumas dicas sobre os meios de cultivo

A fim de facilitar o aprendizado e esclarecer possíveis dúvidas, montei algumas dicas que valem a pena sobre o meio de cultura:

• Se possível, utilize água destilada para garantir uma maior pureza e equilíbrio do meio de cultura. A água comum pode conter sais minerais ou outros químicos que podem influenciar no resultado, porém eu utilizo água mineral sem problemas.
• O açúcar mais recomendado para a utilização é o cristal, podendo ser utilizada a sacarose caso você tenha a disposição. Normalmente as pessoas utilizam o açúcar em 10g a 30g por litro, eu uso 10g por litro.
• O ágar-ágar é usado na concentração de 6g a 10g por litro, eu sempre utilizei 7g por litro e acho uma boa concentração. O ágar-ágar que utilizo é importado, da marca Kanten, porém é achado para vender em lojas de produtos naturais. Falam que o ágar-ágar nacional, feito de Gracilaria maxima, não tem a mesma textura do importado. 
• A água de coco é muito utilizada para fornecer melhores resultados, geralmente na concentração de 10%. Pode ser usado também o suco de laranja recém espremido. Esses produtos são ricos em vitaminas e hormônios que favorecem o bom desenvolvimento da planta.
• Tiamina e inositol podem ser encontrados em farmácia. A tiamina também é conhecida como vitamina B1 e é vendida nos suplementos vitamínicos do complexo B, para facilitar a diluição é melhor comprar em gotas. Para acertar a quantidade, verifique a dosagem de cada suplemento. Eu utilizo metade da dose recomendada para adultos.
• Essas receitas não são fixas e sempre vale a pena fazer testes próprios para analisar a possibilidade de alcançar melhores resultados com novas receitas. Por exemplo: utilizar o adubo NPK com uma quantidade de fósforo maior para facilitar o enraizamento do explante.
• Para fazer quantidades maiores ou menores de meio de cultura, basta fazer a proporcionalidade. Exemplo: se quiser fazer 100ml do meio de cultura Kyoto, utilize 100ml de água + 0,3g de adubo NPK + 1g de açúcar cristal + 0,7g de ágar-ágar + 10ml de água de coco.
• Caso seja de seu interesse, hormônios também podem ser adicionados ao meio. Podem ser hormônios isolados como BAP, AIA e etc ou uma mistura de hormônios e vitaminas como o SuperThrive.
• Algumas pessoas adicionam metilparabeno (ou Nipagin) ao meio de cultura na proporção de 1g por litro para ajudar a controlar contaminações.
• Carvão ativado também pode ser adicionado ao meio na concentração de 2g por litro para absorver toxinas que são liberadas pela planta em uma situação de estresse, que se acumulam no meio e atrapalham o desenvolvimento da planta.
• Ainda não encontrei a dosagem indicada, mas já li que a polivinilpirrolidona (PVP) é adicionada ao meio quando o explante sofre um pardeamento (browning) por conta da esterilização e tem dificuldade em se desenvolver.

Esterilização na cultura in vitro
A esterilização é uma etapa essencial para o estabelecimento de uma cultura in vitro. Por conta da alta umidade, grande oferta de nutrientes e falta de aeração e competição, o ambiente in vitro é muito propenso para o desenvolvimento de fungos e bactérias que podem competir pela tomada do meio com a planta ou torná-lo impróprio. Sendo assim, é importante a esterilização das ferramentas a serem utilizadas, do meio de cultura e dos explantes. Confira a seguir os métodos de esterilização mais comuns.
Ferramentas e materiais

• Calor seco: é mais utilizado para esterilizar ferramentas de metal ou outros materiais que resistem a um alto calor. Para isso, coloque todos os materiais enrolados em papel alumínio e coloque no forno a 160ºC por 30 minutos. Espere esfriar antes de retirar os materiais.
• Calor úmido: é utilizado para esterilizar o meio de cultura (já colocado no recipiente que será usado), vidros, plásticos feitos de polipropileno (PP) e as ferramentas. Para realizar esse método, ponha os materiais que serão esterilizados na panela de pressão com um pano e um pouco de água no fundo, deixe no fogo baixo e apague ele 20 minutos depois que começar a ouvir o barulho de saída de pressão. Espere sair a pressão e esfriar naturalmente antes de retirar os materiais, choques térmicos podem danificar objetos de vidro ou polipropileno.

Lembre-se sempre:

• É recomendado vedar os recipientes contendo o meio de cultura com filmes plástico após a esterilização para diminuir as chances de contaminação.
• Um exemplo de recipiente de polipropileno são os potes coletores de fezes/urina que podem ser encontrados em farmácias.

Como já vimos, o ambiente in vitro é muito propenso para a proliferação de microorganismos invasores que podem impedir o desenvolvimento da cultura. Agora ensinarei a esterilização dos explantes a serem utilizados. Essa esterilização é bem mais sensível. Com uma esterilização muito forte você pode matar o explante, e uma esterilização muito leve contamina o meio de cultura, então o segredo é encontrar um equilíbrio. Confira a seguir algumas etapas pré-definidas para uma boa esterilização:

• Lavagem do explante: após obter o explante escolhido, lavar em água corrente com detergente para retirar restos de substrato, insetos e outros materiais de fácil remoção.
• Assepsia do explante: para realizar esta etapa, existem algumas divisões que podem facilitar a escolha do método a ser utilizado para obter maior sucesso.
• Explantes mais sensíveis: Solução de água sanitária diluída de 5% a 15% em água com uma gota de detergente. Mergulhar o explante em álcool 70 por 30 segundos e em seguida deixar o explante mergulhado nessa solução de 5 a 10 minutos.

Exemplos de explantes: folhas, gemas axilares novas e outros tecidos sensíveis.

Explantes comuns

• Solução de água sanitária diluída de 20% a 30% ëm água com uma gota de detergente.
• Mergulhar o explante em álcool 70 por 1 minuto e em seguida deixar o explante mergulhado nessa solução de 10 a 20 minutos.
• Exemplos de explantes: ápice caulinar ou outras partes do caule da planta.

Explantes resistentes

• Solução de água sanitária diluída:a 50% em água com uma gota de detergente.
• Mergulhar o explante em álcool 70 por 2 minutos e em seguida deixar os explantes mergulhados nessa solução de 20 a 30 minutos.
• Exemplos de explantes: rizomas, sementes e caules lenhosos.

Lavagem: se possível, lavar o explante 3 vezes consecutivas em água estéril (pode ter sido esterilizada junto com os materiais ou adicionar Clorin-10 a ela). O tempo das lavagens deve ser de 1, 3 e 5 minutos.
Algumas observações:

• A água sanitária utilizada deve conter cerca de 2% de cloro ativo.
• Para fazer uma solução de 10% de água sanitária, basta diluir 10mL de água sanitária em 100mL de água e adicionar uma gota de detergente. Para outras concentrações, basta adicionar mais ou menos água sanitária.
• A função do detergente é quebrar a tensão superficial do explante e facilitar a ação da solução asséptica. 
• Quanto menor for o explante, mais sensível ele será a assepsia.
• Quanto maior a concentração da solução, menos precisa ser o tempo do explante mergulhado nela.
• Para determinar qual o melhor método para o seu objetivo, faça seus próprios testes utilizando vários tipos.

Após realizar a assepsia do explante, ele já está pronto para ser inoculado no meio de cultura!